18 de noviembre

 

27 de noviembre 2014.
Preparación de antibiograma.

El antibiograma se usa para:

Conocer la sensibilidad de una bacteria a distintos antibióticos se siembra una muestra del cultivo puro en un medio en el que conocemos la capacidad de difusión de cada una de las sustancias a testar.

Los materiales que usamos para realizar esta practica son:
30 discos de papel filtro aproximadamente

1 frasco de gerber con tapa   

pinzas

placa con muestra problema

antibióticos

 

PROCEDIMIENTO

Para la realización de la prueba en primer lugar hay que sembrar el medio con una gran carga bacteriana que nos permita obtener un crecimiento en tapiz o césped. La siembra se realiza mediante un hisopo estéril que se empapa con el cultivo líquido o se impregna en un cultivo sólido. 

Se descarga el hisopo realizando una estrella en el centro de la placa y extendiéndola posteriormente por toda la superficie procurando que no queden espacios sin cubrir. Una vez sembrada la placa se eligen los antibióticos a testar. 

 

 

 

Ya que los antibióticos están impregnados en discos de papel filtro, se sacan con pinzas metálicas esterilizadas mediante su flameo tras inmersión en alcohol.

 Los discos se depositan en la superficie del medio de cultivo inoculado, realizando una ligera presión para que queden adheridos al mismo. Hay que procurar que queden suficientemente separados unos de otros para que la lectura de resultados sea clara y no hayan interferencias entre la acción de unas sustancias y otras.

 

28 de noviembre

 

La placa preparada con el inóculo y los antibióticos se invierte y se lleva a incubar durante 24 horas a 37ºC. Tras este tiempo, se leen los resultados midiendo el diámetro de los halos de inhibición del crecimiento que aparecen alrededor de los discos de papel.

Se valora la efectividad de los mismos consultando la tabla correspondiente en la que, según el antibiótico, tenemos la capacidad de difusión en el medio y por tanto, la medida de halo que corresponderá a una bacteria sensible, moderadamente sensible/de sensibilidad intermedia, o resistente.

TINCIONES DIFERENCIALES

https://www.dropbox.com/s/2dikpnsw3uvaqr3/TINCIONES%20DIFERENCIALES.docx?dl=0

TECNICAS DE DESINFECCION Y ESTERILIZACION DE MATERIALES.

EL ESPECTO TEORICO A CADA UNO DE LOS EQUIPOS SE LES ASIGNO TEMAS PARA EXPONER Y PODER COMPRENDER MEJOR LOS TEMAS ANTES DE ENTRAR POR COMPLETO A REALIZAR LAS TECNICAS EN EL LABORATORIO
NORMAS BÁSICAS DE ESTERILIZACIÓN

1.        Limpieza

2.        Desinfección

3.        Preparación y empaque de materiales

4.        Esterilización. 

1.        La limpieza consiste en la remoción de la suciedad mediante la aplicación de la energía química, mecánica o térmica en periodo de determinado tiempo y puede ser:

A)       Química  acción de productos de limpieza  tiene  la finalidad de limpiar por medio de las propiedades de la disolución, dispersión y suspensión de la suciedad. 

B)      Mecánica acción física aplicada sobre una superficie para remover la suciedad resistente a la acción de los productos químicos resistente a la acción del producto químico (fregar, cepillar). 

C)      Térmica acción del calor que reduce la viscosidad de la grasa, facilitando la remoción por la acción química.

Etapas de limpieza. 

 1-Prelavado Lavado (manual o mecánico) 

 2- Enjuague y secado.

ANTISEPTICOS Y DESINFECTANTES

Los antisépticos se usan para las personas.(clorhexidina, yodóforos)

Los desinfectantes se usan para los objetos y superficies inanimadas.(alcoholes, cloro y sus derivados, amonios cuaternarios, fenoles, formaldehido, glutaraldehido, peróxido de hidrógeno estabilizado, ácido peracético etc.

Preparación y empaque del material.

Características:  

1. Resistente.    Limpio. Permeable

Existen métodos de esterilización muy comunes que se describen en la siguiente tabla:

Clasificación de métodos de esterilización.

 

MÉTODOS  FISICOS	MÉTODOS QUÍMICOS
Altas temperaturas	Bajas temperaturas
Calor húmedo (autoclave )	121°C-134°C Óxido de etileno 55°C Vapor de formaldehido 60°C
Calor seco (estufa)	Plasma de peróxido de hidrógeno180°C

 

Existen  indicadores que comprueban, que existe un proceso de esterilización completa  además que se consideran muy importantes para verificar el proceso de calidad.

 

a.        Indicadores físicos que son: el termómetro, manómetro de presión, sensores etc.

b.        Indicadores químicos: éstos monitorean directamente la letalidad en un proceso de esterilización.  (Cinta adhesiva mide la temperatura, vira el color).

c.        Indicadores biológicos: son los más confiables ya que se utilizan cepas vivas incubadas a 56°C; consiste en seleccionar un organismo de prueba que posee una resistencia mayor a la esterilización.

CUESTIONARIO

 

ACCION DESTRUCTIVA DEL CALOR SECO.

La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura.
Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.
El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxicos por niveles elevados de electrolitos, fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos.
La acción destructiva del calor sobre proteínas y lipidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja.

Calor Húmedo:
El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se debe principalmente a dos razones:
*El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua.  
*El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire.

 

 ESTERILIZACION

Controles de Esterilidad

Permite controlar en forma probabilística si el material quedó completamente esterilizado pues se testea un porcentaje representativo de todo el material.

Transferencia Directa a Medios de Cultivo
Se transfiere una parte de la muestra a medios de cultivos apropiados que permitan el crecimiento de cualquier contaminante.

• Tioglicolato para anaerobios y aerobios (37°C)
• Tripticasa-Soja para aerobios (25°C)

Las muestras representativas se incuban en estos medios durante un período de 14 días, al cabo del cual no se debe observar ningún tipo de crecimiento.

Puede ocurrir que la muestra no se encuentre estéril pero que no se produzca crecimiento durante la incubación por algún motivo inherente al medio o a la muestra, por ejemplo presencia de algún inhibidor, etc.

Test de Promoción del Crecimiento
Es un testigo del control de esterilidad. Son testigos que se utilizan para los medios de crecimiento del control ya que estos medios tienen capacidad de promover el crecimiento. Para estos testigos se utilizan microorganismos con exigencias nutricionales. Los medios deben ser inoculados con un bajo número de microorganismos, se incuban durante 7 días, al cabo de los que se debe observar un abundante crecimiento.

Test de Bacteriostasis
Es un control que se realiza para determinar si la muestra supuestamente estéril no posee propiedades bacteriostáticas. De esta forma se previenen falsos negativos pues no se produce crecimiento habiendo en la muestra microorganismos viables. Para este test se toman los medios de cultivo con microorganismos de ensayo y se siembran en las muestras a testear. Se incuban durante 7 días. Si se produce crecimiento esto indica que el material no contenía inhibidores.

 

Filtración por Membranas
Se utiliza para determinar la esterilidad de medios de cultivo, soluciones de antibióticos, etc.

Se filtran los medios y se procesa el filtro como en un control de esterilidad para determinar si hay microorganismos presentes.

TYNDALIZACION
 Esterilización por acción discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de TyndalÑ Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones.
Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la válvula de escape, o sea funcionando a la presión normal. Puede también realizarse a temperaturas más bajas, 56º u 80º ocúpara evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.

VENTAJAS DEL CALOR HUMEDO

• Rápido calentamiento y penetración
• Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo
• No deja residuos tóxicos
• Hay un bajo deterioro del material expuesto
• Económico

Desventajas:

• No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
• Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos

ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO

 

El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de sus proteínas celulares. El principal método de esterilización que emplea calor húmedo es la esterilización por vapor a presión.

 Existen otros métodos de descontaminación que emplean este tipo de calor los cuales, aunque no permiten la destrucción total de los microorganismos, disminuyen la carga microbiana que posee un material.

Entre estos métodos podemos citar:

- Tindalización (esterilización fraccionada)

- Agua hirviendo

- Pasteurización

- Olla de presión

Esterilización por vapor a presión

La esterilización por vapor a presión se lleva a cabo en un autoclave. Estos equipos emplean vapor de agua saturado, a una presión de 15 libras lo que permite que la cámara alcance una temperatura de 121ºC. El tiempo de esterilización usualmente es de 15 minutos, sin embargo, en algunas oportunidades, dadas las características del material, es necesario variar el tiempo de esterilización.

Cuando se utiliza este método es importante controlar en el autoclave la relación entre la temperatura, la presión y el tiempo de exposición, ya que éstos son factores críticos en el proceso.

 

Sólo cuando el vapor se coloca bajo presión, es cuando su temperatura aumenta por encima de los 100 ºC y esto permite alcanzar las temperaturas de esterilización (121 ºC).

Entre las ventajas de este método de esterilización tenemos que no deja residuos, los autoclaves modernos son sencillos de manejar y es un método rápido de esterilización.

Éste es el método de elección para esterilizar materiales termoestables y no sensibles a la humedad como medios de cultivo, cultivos de microorganismos para descartar, lencería, uniformes, instrumentos quirúrgicos, etc.

Entre sus desventajas están que no permite la esterilización de materiales sensibles al calor y materiales no miscibles con el agua como es el caso de polvos, aceites y grasas.

FUNCION DE LA AUTOCLAVE

Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland. Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar)y se deja el material durante 20 a 30 minutos.
Equipo:
Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica, esta se cierra en la parte superior por una tapa de bronce. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete y el tercero, para una válvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte.

Funcionamiento:
Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla de metal. Se cierra asegurando la tapa, sin ajustar los bulones y se da calor, dejando abierta la válvula de escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salidÔ9de vapor en forma de chorro continuo y abundante.
Precauciones en el uso del autoclave

- Antes de comenzar el proceso de esterilización es necesario remover todo el aire de la cámara del autoclave, porque de lo contrario no se podrán alcanzar las condiciones de esterilización requeridas debido a que la cámara interna del equipo no podrá ser saturada por el vapor de agua.

 

- El tiempo de esterilización se debe comenzar a contar una vez que se han  alcanzado los 121ºC en la cámara interna del autoclave.

- Si se van a esterilizar materiales tales como instrumentos quirúrgicos, equipos, etc. No se deben cubrir con materiales impermeables al agua como por ejemplo el papel de aluminio, porque éste no permite que el vapor tenga acceso al material y por lo tanto no se logrará la esterilización.

- Cuando se coloca el material a esterilizar en el interior del equipo se debe garantizar la libre circulación del vapor de agua alrededor de todo el material.

Para controlar la esterilización por vapor a presión se emplean indicadores físicos tales como medidores de presión, termómetros, o termógrafos. Aunque estos controles son ampliamente utilizados, actualmente se consideran métodos secundarios para el control del proceso y son los indicadores biológicos los que permiten determinar si realmente se llevó a cabo en forma efectiva la esterilización.

 

BITACORA SEMANA 3

HOLA, esta es la tercera semana de clases y aquí les dejo mi bitácora detallando las actividades que se realizaron día a día.

https://www.dropbox.com/home?select=BITACORA%20SEMANA%203.docx

ACTIVIDAD 2

Fuente de obtención de los colorantes.

Atendiendo a la fuente de obtención, los colorantes se clasifican en naturales y sintéticos.

Colorantes naturales. Los colorantes naturales son básicamente histológicos, encontrándose entre los empleados con mayor frecuencia, los siguientes:

• Índigo: Se obtiene de diversas especie de plantas del genero indigófera que contiene indican, el cual se fermenta para producir el colorante.
• Carmín: Se produce, mediante el tratamiento con alumbre y otras sales metálicas a hembras del insecto cochinilla "Coccus castis".
• Orceína y Tornasol: Se obtiene mediante el procesamiento industrial de líquenes de los géneros: Le canora tinctoria y Rosella tinctoria.
• Hematoxilina: Este colorante se extrae con éter de la madera de un árbol oriundo de México y de algunos países suramericanos denominados Hematoxilium campechianum.

Colorantes sintéticos. Se obtiene de la anilina, o es mas exactamente del alquitrán de hulla siendo todos derivados del benceno.

Clasificación

Los colorantes se clasifican, teniendo en cuenta si la propiedad tintorial se encuentra en el anión o el catión de su estructura química. Sobre esta base se pueden dividir en tres grupos: básicos, ácidos y neutros.

• Colorantes básicos: La acción colorante está a cargo del catión, mientras que el anión no tiene esa propiedad, por ejemplo: - cloruro de azul de metileno+.
• Colorante ácido: Sucede todo lo contrario, la sustancia colorante esta a cargo del anión, mientras que el catión no tiene propiedad, por ejemplo: eosinato- de sodio+
• Colorantes neutros: Están formados simultáneamente por soluciones acuosas de colorantes ácido y básicos, donde el precipitado resultante, soluble exclusivamente en alcohol, constituye el colorante neutro, que tiene la propiedad tintorial de sus componentes ácidos y básicos, por ejemplo: la giemsa.

Afinidades tintoriales.

En el proceso de la coloración, ocurre una combinación de reacciones físicas y químicas.

• Reacción física.

Ocurre un fenómeno de absorción similar al que tiene lugar en las materias porosas, considerando que el colorante penetra en los intersticios del cuerpo coloreable y se mantiene allí por la cohesión molecular. 

·         Reacción química

Las células microbianas son ricas en ácidos nucleicos que portan cargas negativas en formas de grupos fosfato combinándose como colorante básicos cargados positivamente. Los colorantes ácidos que tienen la acción colorante en el anión no tiñen la célula, se emplean como colorante de contraste para colorear su entorno, como por ejemplo: la tinta china o la eosina que no colorea al microorganismo, pero si el fondo del campo microscópico.
 

Toxicidad de los colorantes. Ventajas y Desventajas.
 

Los colorantes son sustancias tóxicas, por lo tanto el proceso de la tinción generalmente resulta letal para los microorganismos, provocando su inmovilización, lo cual puede significar una ventaja o desventaja para el investigador según sean los objetivos con la sustancia colorante. Veamos algunos Ejemplos:

1. Al ocasionar la muerte de los microorganismos sometidos al proceso de tinción se reducen las posibilidades de contaminación para el manipulador.
2. Los colorantes pueden ser tóxicos para el manipulador, algunos incluso han resultado cancerígenos por lo que ha habido la necesidad de retirarlos del mercado.
3. Algunos colorantes solo tienen afecto letal para determinadas especies o géneros bacterianos, siendo utilizados como constituyentes de medios de cultivo selectivo para impedir el desarrollo de microorganismos indeseables y favorecer el desarrollo de las especies que nos interesa estudiar. Por ejemplo: el verde de malaquita.
4. Otros se emplean como desinfectantes microbianos, más que para teñir, con fines de microscopia, por sus propiedades bacterianas o bacteriostáticas.
5. Algunos tipos de colorantes son empleados no para teñir, sino como indicadores de pH, formando parte de la composición de los medios de cultivo para indicar los cambios de basicidad o acidez que se vayan produciendo en el medio como consecuencia de su actividad metabólica. Ejemplo: rojo fenol, azul de bromo timol entre otros.

ACTIVIDAD 1
a) Después de compartirles el video con anterioridad "Morfología de las colonias bacterianas" describiré algunas de las colonias y mencionare diversos géneros con sus características.

• Borde lacerado, forma irregular y rizoide,Color perla.
• Borde irregular,rizoide filamentosa
• Forma irregular en roseta, dentada, elevación crateriforme. Opaco.
• Borde dentado, textura escamosa, forma rizoide, elevación umbilicada.

 

Klebsiella, en agar Mac Conkey. 

Colonias grandes plano convexa, mucoides, brillantes, forma irregular, también se observan redondeadas, bordes ondulados, lactosa positivo.

 

                                       

 

Bacillus 

Colonias medianas, convexas, blanquecinas como cera, forma  fusiforme y circular, bordes redondeados.

                                     

                                                          

Escherichia coli.

Se logran ver colonias aisladas,  son colonias medianas, circulares, convexas, moradas, contorno verde-metalico, bordes redondeados.

 

                                              





 

 

 

b) Significado de cultivo puro y mixto.

 

Cultivo puro (axénico):cultivo de laboratorio que contiene una sola especie de organismo.
Los cultivos puros se obtienen habitualmente de cultivos mixtos (que contienen varias especies), por métodos que separan las célulasde modo que, cuando se multiplican, cada una formará una colonia distinta, que luego puede usarse para establecer nuevos cultivos con la seguridad de que tendrán sólo un tipo de organismo. Los cultivospuros se obtienen más fácilmente si el medio de crecimiento empleado para el cultivo mixto original favorece el desarrollo de un organismo con exclusión de otros.

La diferencia entre los dostipos de cultivos es que el cultivo mixto, contiene dos o más especies o cepas del organismo; y en el cultivo puro (o axénico), todos los organismos son de la misma especie (o cepa).